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【钛和投研报告】 CRISPRCas技术在分子诊断的应用

文章作者:程序开发 上传时间:2019-08-30

  从鲜有人听闻突然变成了生物科学领域最炙手可热的前沿技术。“贺建奎基因编辑婴儿事件”更是让基因编辑这一概念在国内得到了一定程度的科普。在大众还在畅想基因编辑如何改变未来人类的基因图谱的时候,CRISPR技术正在快速地发展并已能应用于诊断领域,我们认为CRISPR技术的出现将会给整个分子诊断技术的发展带来巨大的改变。

  首先要说明的是CRISPR/Cas系统并不是哪个天才突发奇想构思出来的东西,而是在大自然中天然存在的细菌面对噬菌体威胁经年累月进化出来的产物,只是被人们发现了这一特性并加以利用。

  “成簇的规律间隔的短回文重复序列”听上去十分得拗口和晦涩,通过下图可以更直观得帮我们理解CRISPR的概念。

  首先,一个CRISPR序列是由一连串短(Short)的重复序列(Repeats)构成,Repeats是细菌的固有序列,含有回文(Palindromic)序列,可以形成发卡结构,能够同时结合Cas蛋白和Spacer序列。Repeats之间规律间隔的就是间隔区(Spacer),Spacer则是细菌(或是其祖先)感染过的病毒序列,一旦噬菌体感染发生,绝大多数细菌死亡,极少部分的细菌由于其基因变异得以生存,这些细菌中的一部分,将噬菌体的DNA序列切割后,插入Repeat区域中,形成Spacer,从而获得类似高等生物“免疫记忆”的能力。因此可以形象把Spacer区域理解为“病毒黑名单数据库”,当黑名单上记载的外源遗传物质入侵时,CRISPR/Cas系统将给予精确打击。CRISPR的上游前导区(Leader)被认为是CRISPR序列的启动子,再上游还有一个多态性的家族基因Cas,该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。Cas基因与CRISPR序列共同进化,形成了在细菌中高度保守的CRISPR/Cas系统。目前发现了Cas1-Cas14等多种类型的Cas基因。

  弟1步:外源DNA捕获,简单说就是识别入侵者身份。CRIPR/Cas9系统取得一段外源DNA后,在“黑名单数据库”搜索引擎中自动搜索,并确认病毒的身份,确认身份后会从这段外源DNA中截取一段序列作为新的黑名单数据加入到Spacers中,并将旧的身份数据进行移除。

  第2步:crRNA的合成,形象点比喻就是准备作战工具。病毒入侵时,CRISPR序列会在前导区的调控下转录出pre-crRNA和tracrRNA,其中tracrRNA是由重复序列区转录而成的具有发卡结构的RNA,而pre-crRNA是由整个CRISPR序列转录而成的大型RNA分子。Pre-crRNA、tracrRNA及Cas9编码的蛋白将会组装成一个复合体,将前一步中获得的入侵者的身份信息复制出来形成一段短小的crRNA,crRNA、Cas9以及tracrRNA组成最终复合物,为下一步剪切做好准备。

  第3步:靶向剪切,就是消灭入侵者。Cas9/复合物会扫描整个外源DNA序列,并识别出与crRNA互补的序列。这时,复合物将定位到该区域,DNA双链将被解开。crRNA将与互补链杂交,而另一条链则保持游离状态。随后,Cas9蛋白发挥作用,剪切crRNA互补的DNA链和非互补的DNA链。最终,Cas9使双链断裂,外源DNA的表达被沉默。

  CRISPR/Cas最精妙和最让人着迷的地方在于能够快速便捷地定向精确的找到靶基因并对其进行编辑。编辑的内容不仅包含上述提到的剪切/敲除(knock out)还包括替换/写入(knock in)。

  在真核细胞中,DNA双链在断裂后是有自我修复机制的,这种修复机制主要有两种:非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)。

  ●NHEJ修复机制不需要任何模板,修复蛋白直接将双股断裂的DNA末端彼此拉近,在DNA连接酶的帮助下重新接合。

  ●HDR被认为是更准确的断裂修复机制,但它需要修复模板的存在,同时要求受损DNA和供体DNA链之间具有更高的序列同源性。

  人们只要将想要敲入的基因放入修复模板中,便能通过HDR机制实现基因的敲入。但是NHEJ的活性远高于HDR,是DNA修复途径中占据支配地位的机制,而科学家面临的挑战就是如何抑制NHEJ因子以及如何提高HDR的效率。

  在获得这把上天赋予的“神奇剪刀”后,人们首先想到的就是进行人体基因治疗,通过定向地改变致病DNA来治疗一些过往无法治疗的遗传病。但由于CRISPR还存在脱靶效应,以及人们对某段基因敲除或敲入带来的远期影响还不十分清晰,因此在人体上进行基因编辑在欧美20多个国家都是法律明确禁止的,但中国对于基因编辑并无专门的法律规范。

  2015年4月中山大学黄军团队利用CRISPR技术编辑了86个无活性人类胚胎,以期能修改导致地中海贫血的HBB基因,但在接受检验的54个胚胎中只有4个成功插入了正确的基因,1/3存在脱靶。

  此事在当时就在国际上引起了轩然大波。去年的贺建奎基因编辑婴儿事件更是把CRISPR技术推到了风口浪尖。我们相信未来等到技术成熟的时候,CRISPR技术是会应用到人体遗传病治疗的,但目前谈论这个显然是操之过急了。

  虽然CRISPR目前还不能直接用于活体基因治疗或者胚胎改造,但在人体胚胎上的实验在全球各地仍在进行当中。CRISPR在其他的领域的应用也在如火如荼的开展当中,例如农作物育种、和CART的结合、利用CRISPR技术发现新药、新的抗生素等等,这里重点想介绍一下CRISPR技术在分子诊断上面的应用。

  2018年2月15日,国际著名期刊《SCIENCE》同时发表了两篇重磅文章,分别来自CRISPR界的两座大山--MIT的张锋实验室和UC Berkeley的Doudna实验室。

  这里首先要说明一下两个不用于Cas9的Cas家族成员Cas12a和Cas13a。

  Cas12a/Cas13a蛋白都具备一种叫做“collateral effect”的效应,简单说来就是,当Cas12a/Cas13a和crRNA结合,并识别相应的RNA序列之后,就激活了Cas12a/Cas13a的RNA酶活性,能够切割其他所遇到的任何RNA,这就是所谓的‘collateral effect’。此时,这个酶就会剪切一个荧光报告基团(quenched fluorescent RNA,实际上是一种高灵敏的检测RNA酶活性的试剂,正常情况下不发光,一旦被RNA酶剪断,就会发光,然后只需要检测到荧光就能够判断是否具有RNA酶活性了),然后发光,其后就可以被检测了。这就是利用Cas12a/Cas13a蛋白做基因诊断的原理。简而言之,Cas9是发现目标剪切目标,而Cas12a/Cas13a则是发现目标剪切目标以外的其他。

  Doudna 团队使用Cas12a蛋白开发出了DETECTR(DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter)系统。它可以准确地识别人源样本中不同类型的 HPV 病毒,并通过与等温核酸扩增技术的联用提高了灵敏度。到目前为止, DETECTR可以100%准确地检测出HPV16感染,92%准确地检测出 HPV18 感染。而且单次成本不到一美元,时间只需一个小时。

  张锋团队则是利用Cas13a研发出升级版基因突变检测工具SHERLOCK V2。为了提高灵敏度,SHERLOCK V2同样采用了等温扩增技术。和DETECTR的区别在于SHERLOCK V2设计的荧光报告基因必须是特异性,而DETECTR则是非特异性的。然而,也正是“特异性”这个优点使得 SHERLOCKv2 可以在同一样品中同时检测出多种病毒感染,比如能同时检出寨卡和登革热病毒,只需要在系统加入不同细菌不同的Cas13酶。这些不同的 Cas13 酶对不同的RNA序列表现出不同的“偏爱”程度。换句话说,同时向细胞递送多种酶和多种不同荧光报告基团,一旦 CRISPR 系统发现目的基因,对应的Cas13就会启动剪切酶活性,剪切相应的荧光报告基团,从而释放出荧光信号。

  2019年3月25日,Keck研究所与加州大学伯克利分校的研究人员将CRISPR技术的强大功能与石墨烯的超灵敏度结合起来,创造了一种可在几分钟内检测出特定基因突变的新型手持设备CRISPR-Chip,可用于快速诊断遗传疾病或评估基因编辑技术的准确性。目前这一团队已经使用该装置识别了来自Duchenne肌营养不良症患者的DNA样本中的基因突变。

  该技术让人眼前一亮,首先研究人员找到了一种失活的Cas9蛋白--一种可以在DNA上找到特定位置但不会切割它的Cas9变种。其次信号采集用的是石墨烯制成的晶体管,石墨烯是由单个原子碳层构成,具有超高的电敏感性。因此当CRISPR复合物在其靶向的DNA上找到位点时,它会与其结合并触发石墨烯的电导率发生变化,从而改变了晶体管的电特性。这一过程仅仅需要数分钟就能完成,而且更重要的是石墨烯超高的电敏感性使得该反应无需PCR扩增就能准确检测到信号,这意味着它可以用于野外工作环境中进行基因检测,不用再将样品送到实验室。快速、高效、无需扩增,这使得CRISPR-Chip具备了许多其他检测手段包括其他CRISPR检测不具备的优良特性。

  CRISPR/Cas技术引起科学界的重视也不过是最近数年的事情,但CRISPR技术在人体遗传病治疗与预防、农作物育种、新药开发及分子诊断等多个方向上的应用正在快速地发展。仅仅两年时间,我们就在市场上看到了DETECTR、SHERLOCK V2、 CRISPR-Chip三款基于CRISPR/Cas技术的分子诊断产品,也看到了Cas12、Cas13和变种Cas9等新的Cas家族成员,未来各种具备其他特性的Cas酶也会被人们发现并加以利用,结合上创新的信号检测手段及其他技术,分子诊断在时间、成本、灵敏度、体积等几个维度上都会因为CRISPR技术得到革命性的改变。

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