当前位置:澳门新葡亰亚洲在线 > 程序开发 > 镍柱纯化蛋白为什么把所有流出液电泳都没有看

镍柱纯化蛋白为什么把所有流出液电泳都没有看

文章作者:程序开发 上传时间:2019-02-12

  你his-tag的包涵体蛋白,用尿素洗脱,其pH值是多少?需要用低pH;如果pH不够,极可能你的蛋白还在柱上。

  此外,你有没尝试过柱上复性,以避免用尿素洗脱?更多追问追答追问我用了三个梯度的ph,一个8.0,一个5.9,另一个4.3的追答遇到这种情况,确实很纠结。既然你确信蛋白是表达出来了,现在的问题还是从两方面找:

  1,没挂上去去?还是我前面说的,电泳检查你的流穿液,对比上样前的样品,确信蛋白石结合到柱上;

  2,没洗下来?我不知道你在洗蛋白时,是否用了紫外监测仪,如果没有,你是怎样收蛋白的?多大体积分开收集?你使用了5.9的洗脱液,一种可能是你的蛋白和填料的结合力不够强,在pH5.9的洗脱液中缓慢洗脱,没集中出峰,但又被洗下来了。建议你不要用梯度pH,就用一个低pH一次搞定。追问我用TCA检测流出液,但我们实验室的那个TCA有问题,师姐叫我下次改另一个方法。每次我用3ml洗脱,用5ml离心管收集,每个梯度洗三次。改天我到实验室换用咪唑试试。请问下咪唑和尿素洗脱有什么区别吗?追答我不知道你用的是什么样的ni柱,但与ni柱的亲和层析,洗脱往往是两种方式:低p值溶液降低蛋白与ni的亲和力;咪唑竞争性结合以洗脱蛋白。

  我前面说“你有没尝试过柱上复性,以避免用尿素洗脱? ”是表达不准,意思是用柱上复性,再洗脱,以避免蛋白溶液中含尿素,尿素并不是使其洗脱的因素。

  谢谢你,我昨天已经到实验室用咪唑做了,明天去看看结果怎么样。有问题,我在请教你啊

  电泳应该没问题,我重复做了两次,结果都一样的。洗脱液我们用的是8M的尿素,都是我现配的,应该也不会有问题啊。纯化过程讲解,这个怎么讲啊,能不能具体点?

  把纯化前后的各组分在同一张胶片上跑,确认下蛋白是在穿透里还是在柱子上没有洗脱下来,如果是在柱子上可以尝试更低的pH,比如3.5,或者使用咪唑梯度洗脱。区别大了,实验中用尿素目的是保持蛋白的变性状态,但是尿素不能洗脱挂在柱子上的蛋白,而咪唑可以,它能竞争性的结合Ni,使目标蛋白与柱料分离,达到洗脱目的。

转载请注明来源:镍柱纯化蛋白为什么把所有流出液电泳都没有看