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蛋白过镍柱纯化的过程中 咪唑是哪部用的啊 什么

文章作者:程序开发 上传时间:2019-02-12

  Ni柱中的氯化镍可以与有HIs(组蛋白)标签的蛋白结合,也可以与咪唑结合。

  步骤是:过柱子前可以选择Ni柱重生,也就是往柱子里倒氯化镍,一个柱长体积就行了,然后平衡柱子,拿你自己的buffer,给蛋白提供最适的环境,我一般平衡4个柱长,然后蛋白上样,你可以让他自己挂,这样挂柱子的效果好一些,如果流速太慢,可以加个恒流泵,但是一定不能太快,太快挂柱效果差,当然你也可以选择循环挂柱,就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯,从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。挂完之后,按理想来讲,你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了,杂蛋白多数在烧杯里,留下来了,当然肯定有少量杂蛋白也挂上了,这时候你要梯度洗脱,拿咪唑和你的buffer配,一般从0 20mM 40mM。。。。100mM这样洗脱(当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候)我指的是咪唑的终浓度。咪唑加入之后,会和蛋白争夺与Ni的结合位点,杂蛋白、你的目的蛋白,会在不同的浓度被洗脱下来,洗完之后,你可以用400mM咪唑洗柱子,清理一切蛋白,然后平衡几次,是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~

  这是我的经验,楼主可以多方面参考下别人的。喜欢推荐我的答案哦,~(≧▽≦)/~请问什么叫平衡啊??平衡4个柱长??什么意思啊?谢谢啊 ,就是 比方说你原来柱子里加的是a溶液,就像润洗的道理一样,目的是让柱子里面都是b溶液就要拿b溶液多过几遍柱子,让柱子从上到下“平衡”,免得上面是b下面是a的,4个柱长就是灌一次满柱,等流到beads液面时再加满柱,加4次,当然要看你的柱子什么样,不同的柱子标准不一样,太长的柱子加4个不是太久了么,而且没用,看你的实际多长。

  查多点文献,binding buffer里面有些人会加5-20mM的咪唑的,也有不加的。你做一个梯度洗脱,看看哪个mM的咪唑能把大部分的杂蛋白洗下来,也就是wash buffer,一般可以设20,,30,40,50.... 最后是elution buffe,把你的目的蛋白洗下来r。原理就是竞争洗脱

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